24. November 2017, Thema: Aquatische Ökotoxikologie

Immuntoxizität: eine unterschätzte ökotoxikologische Wirkung von Chemikalien

Zahlreiche Stoffe beeinflussen die Fähigkeit von Wildtieren, mit Krankheitserregern fertig zu werden. Noch gibt es aber keine anerkannten biologischen Tests im Bereich der Ökotoxikologie, um Umweltproben und Chemikalien auf immuntoxische Wirkungen zu screenen. Das Oekotoxzentrum möchte hier Abhilfe schaffen. 

Schadstoffe in der Umwelt beeinflussen nicht nur direkt das Überleben von Organismen, sondern können auch über subtilere Wirkungen auf die „Fitness“ von Arten einwirken. Diese Wirkungen sind zwar nicht unmittelbar sichtbar, beeinträchtigen aber die Fähigkeit der Tiere, auf andere Stressfaktoren zu reagieren, und verringern so ihre Fähigkeit zu überleben, zu wachsen und zu reproduzieren. Ein wichtiger Angriffspunkt für solch indirekten Wirkungen ist das Immunsystem: Für Wildtiere belegen eine Reihe von Feld- und Laborstudien, dass Umweltchemikalien die Funktion des Immunsystems beeinflussen. Ein bekanntes Beispiel ist der weltweite Rückgang der Amphibienpopulationen. Als ein zentraler Faktor für den Amphibienrückgang gelten Infektionen mit Pathogenen (Parasiten, Viren, Pilze). Es wurde gezeigt, dass eine gleichzeitige Belastung mit Chemikalien zu einer Unterdrückung des Immunsystems der Tiere führen kann und sie damit empfänglicher für die Infektion durch Pathogene macht. Ein anderer gut untersuchter Fall sind Staupe-Epidemien bei Meeressäugern wie Schweinswalen, Delfinen, Seehunden und Robben, denen jeweils Tausende von Tieren zum Opfer fallen. Der Ausbruch der Krankheit wird mit der Anreicherung von immunsuppressiven polychlorierten Biphenylen in den Meeressäugern in Verbindung gebracht. Wichtig ist, dass die immuntoxischen Wirkungen von Chemikalien mit den immunmodulierenden Effekten anderer Stressfaktoren zusammenwirken. Derartige kumulative Effekte könnten eine Erklärung dafür sein, warum Infektionskrankheiten bei Wildtieren in einem nie dagewesenen Tempo zunehmen. 

Fehlende Screeningtests

Obwohl Immuntoxizität also eine wichtige Rolle spielt, gibt es in der Ökotoxikologie in diesem Bereich noch keine anerkannten Prüfverfahren. Ein erster Schritt, um dieses Defizit zu beheben, wäre die Entwicklung von einfachen Screeningtests zur Erfassung immuntoxischer Potenziale von Chemikalien und Umweltproben. Daher hat das Oekotoxzentrum zusammen mit dem Zentrum für Fisch- und Wildtiermedizin (FIWI) der Universität Bern ein Projekt gestartet, um ausgewählte Immunendpunkte systematisch auf ihre Fähigkeit zu testen, Chemikalien mit immunmodulierendem Potenzial zu detektieren. Dabei darf der Screeningtest falsch-positive Ergebnisse liefern, aber keine falsch-negativen. Diese Stoffe können dann in weiterführenden Tests näher charakterisiert werden. 

Als Kandidat für einen immuntoxikologischen Screeningassay wurde ein in vitro-Ansatz mit isolierten Immunzellen (Leukozyten) der Regenbogenforelle ausgewählt. Die Auswahl des Verfahrens basierte auf einer ausführlichen Literaturauswertung: „Wir haben beschlossen, die Immunendpunkte für den Screeningassay zu prüfen, welche bisher am häufigsten für die Bewertung der Immuntoxizität in Fischen eingesetzt wurden“, erklärt Kristina Rehberger (FIWI). Für die Charakterisierung des Assays sind drei Überlegungen wichtig: (I) Zunächst muss in einem Zelltest klar unterschieden werden zwischen der allgemeinen zytotoxischen Wirkung der Testchemikalien und ihrer spezifischen immuntoxischen Wirkung. Deshalb wurde für jede Testchemikalie zunächst der zytotoxische Konzentrationsbereich bestimmt und daraus der nicht-zytotoxische Konzentrationsbereich für den Screeningtest abgeleitet. (II) Dann muss bei immunologischen Prüfverfahren klar unterschieden werden zwischen der Reaktion des ruhenden Immunsystems und des durch ein Antigen oder Pathogen aktivierten Immunsystems – die Antwortmuster des ruhenden und des aktivierten Immunsystems können sich deutlich unterscheiden. (III) Schliesslich ist die Auswahl der Testchemikalien kritisch: Es müssen sowohl Stoffe getestet werden, für die eine spezifische immuntoxische Wirkung in Studien mit Fischen nachgewiesen ist, wie auch nicht-immuntoxische Stoffe. Dabei sollte die Gruppe der immuntoxischen Testchemikalien unterschiedliche molekulare Wirkweisen einschliessen. 

Verschiedene Endpunkte

Die Wirkung der Testchemikalien auf die Funktion der Immunzellen wird in diesem Projekt über drei Endpunkte erfasst, welche alle durch Chemikalen beeinflusst werden können. Der erste Endpunkt misst die Phagozytoseaktivität der Immunzellen. Die Phagozytose von körperfremdem Material z.B. Bakterien oder geschädigtem körpereigenem Material wie z.B. Krebszellen ist eine wichtige Funktion der angeborenen Immunantwort. Bei diesem Prozess werden zum Beispiel die Krankheitserreger in die Immunzellen aufgenommen um danach verdaut zu werden. Chemikalien können die Fähigkeit der Immunzellen zur Phagozytose verändern. Um eine einfache Messbarkeit des Phagozytoseprozesses zu erreichen, werden die isolierten Forelleleukozyten anstelle von Krankheitserregern mit Fluoreszenz-markierten Latexkügelchen versetzt. Anschliessend wird per Durchflusszytometrie der Anteil der Zellen bestimmt, welcher Latexkügelchen aufgenommen hat, also phagozytotisch aktiv war. 

Ein zweiter wichtiger Endpunkt ist die Messung der oxidativen Burst-Aktivität der Fischleukozyten. Die durch Phagozytose aufgenommenen Krankheitserreger müssen in den Zellen verdaut werden. Dazu produzieren die Phagozyten reaktive Sauerstoffspezies („Sauerstoffradikale“). Auch die oxidative Burst-Aktivität der Leukozyten kann durch Chemikalien verändert werden. Methodisch wird zur Messung der oxidativen Burst-Aktivität ein kolorimetrischer Test eingesetzt, der NBT-Assay: Dabei wird das gelbe, lösliche Substrat Nitroblauterazoliumchlorid (NBT) durch reaktive Sauerstoffspezies innerhalb der Zellen zu einem blauen, unlöslichen Di-Formazan-Farbstoff reduziert. Dieser wird anschliessend im Photometer quantifiziert. 

Der dritte getestete Immunendpunkt ist die RNA-Expression ausgewählter Zytokine. Zytokine sind wichtige Signalproteine, welche eine wesentliche Rolle für die Kommunikation innerhalb des Immunsystem spielen. In der Studie wurde die RNA-Expression der Forellenleukozyten von drei Zytokinen, die häufig in immuntoxischen Studien mit Fischen gemessen wurden, mit Hilfe der qRT-PCR (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction) analysiert. Die ausgewählten Zytokine sind die entzündungsfördernden IL (Interleukin)-1β und TNF(Tumor necrosis factor)α sowie das entzündungshemmende IL-10. 

Sind die Fischleukozyten-Tests als immuntoxikologisches Screening-Verfahren geeignet?

Um die Eignung der Immunendpunkte als Screeningmethode zu beurteilen, wurden fünf Chemikalien mit immuntoxischer Wirkung in Fischen sowie drei nicht-immuntoxische Chemikalien ausgewählt. Die immunmodulierenden Stoffe haben bekannte aber unterschiedliche Wirkmechanismen: Der Entzündungshemmer Dexamethason wirkt über den Glucocorticoidrezeptor. Das synthetische Hormon Ethinylöstradiol, das zur Empfängnisverhütung eingesetzt wird, wirkt über den Östrogenrezeptor. Bisphenol A, ein Bestandteil einiger Plastikarten, wirkt ebenfalls über den Östrogenrezeptor, kann aber auch andere immunologisch relevante Signalwege aktivieren. Der aromatische Kohlenwasserstoff Benzo(a)pyren wirkt über den Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor auf das Immunsystem und das Schmerzmittel Diclofenac entfaltet seine immunologische Wirkung über die Hemmung des Enzyms Cyclooxygenase. Als Stoffe mit nicht immunmodulierender, sondern unspezfischer („narkotischer") Wirkung wurden das Frostschutzmittel Ethylenglykol und die Industriechemikalien Butanol und 1,2,4-Trichlorbenzol eingesetzt. Die Hälfte der isolierten Fischzellen wurde zudem vor der Chemikalienexposition mit Lipopolysacchariden des Bakteriums E. coli stimuliert, um eine Aktivierung des Immunsystems zu erreichen. 

Die ersten, vorläufigen Ergebnisse sind vielversprechend: Die fünf immunmodulierenden Stoffe Dexamethason, Ethinylöstradiol, Bisphenol A, Benzo(a)pyren und Diclofenac führten vor allem bei der Phagozytose und der oxidativen Burst-Aktivität zu Effekten. Die Testsubstanz Dexamethason beispielsweise hemmte nicht nur die Phagozytose und die oxidative Burst-Aktivität signifikant, sondern auch die RNA-Expression der Zytokingene IL-1β und TNFα. Die detaillierten Ergebnisse werden bald als Bericht verfügbar sein.