18. Mai 2020, Thema: Aquatische Ökotoxikologie

Nachweis von Schadstoffen in Lebensmittelverpackungen

Lebensmittelverpackungen enthalten komplexe Mischungen von Chemikalien. Eine neue Methode kann deren Toxizität empfindlich messen und hilft herauszufinden, welche Stoffe für die Toxizität verantwortlich sind.

Lebensmittelverpackungen enthalten zahlreiche Substanzen, die in geringen Mengen auch in die verpackten Nahrungsmittel wandern können. Nach neueren Schätzungen sind es insgesamt 12000 Chemikalien, die bei der Produktion der Folien, Schalen, Kartons und Konservendosen eingesetzt werden, in denen wir unser Essen nach Hause tragen. Ein Teil davon sind Reaktions- oder Abbauprodukte der Ausgangssubstanzen, die jeweils unbeabsichtigt entstehen und deren Struktur und Eigenschaften nicht bekannt sind. Doch welche Stoffe können wirklich in die Nahrung wandern? Und welche davon sind toxisch für uns?

Es ist nicht realistisch, alle Einzelstoffe chemisch zu analysieren. Daher wird momentan ein vielversprechender neuer Analyseansatz getestet, der Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) mit Biotests und Massenspektrometrie kombiniert „Bei dieser Methode trennen wir zunächst die toxischen Stoffe von den anderen Stoffen ab und versuchen sie dann zu identifizieren“, erklärt Postdoktorand Alan Bergmann. Er hat die Methode am Oekotoxzentrum für hormonaktive und gentoxische Stoffe etabliert und optimiert. „Wir können so nicht nur die Toxizität von unbekannten komplexen Proben messen, sondern auch die verantwortlichen Stoffe herausfiltern und charakterisieren.“ Die Methode lässt sich nicht nur auf Verpackungen anwenden, sondern auch auf Abwasser-, Trinkwasser- und Fliessgewässerproben. Auftraggeber des Projekts ist das Bundesamt für Lebensmittelsicherheit und Veterinärwesen, Projektpartner die Eawag und die Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften.

Nur die toxischen Stoffe werden analysiert

Manche der Chemikalien, die in Lebensmittelverpackungen auftreten können, sind schon als schädlich bekannt. Ein Beispiel dafür sind die östrogenen Stoffe, die natürliche Hormone imitieren und dadurch das Hormonsystem beeinflussen. Für viele Stoffe gibt es jedoch nicht genügend Toxizitätsdaten oder sie sind sogar komplett unbekannt. Die neue Methode trennt die komplexen Stoffmischungen in einem ersten Schritt in Einzelstoffe oder Stoffgruppen auf. Die Proben werden dazu auf eine Dünnschichtplatte aufgetragen und wandern dort je nach Masse und Polarität in definierte Banden. In einem zweiten Schritt wird die Toxizität dieser Banden mit Hilfe eines Biotests gemessen. Der Test wird direkt auf der Dünnschichtplatte durchgeführt und macht toxische Banden über ihre Fluoreszenz sichtbar. Die Banden lassen sich anschliessend von der Platte entfernen. Mit Hilfe von hochauflösender Massenspektrometrie (LC-HRMS/MS) kann dann gezielt die Struktur der toxischen Stoffe bestimmt werden.

Alan Bergmann hat die Methode am Oekotoxzentrum zunächst für östrogene Stoffe etabliert. Dazu muss der Hefezell-Östrogentest (YES), der normal in Mikrotiterplatten durchgeführt wird, auf die Verwendung mit Dünnschichtplatten angepasst werden. Der YES weist östrogene Stoffe über ihre Bindung an den menschlichen Östrogenrezeptor nach, der in genetisch veränderte Hefezellen eingebaut und mit einem Reportengen gekoppelt ist. Bindet ein östrogener Stoff an den Rezeptor, so wird ein Reportergen abgelesen und führt zur Bildung eines Enzyms, das einen Indikatorstoff in eine andere Farbe umwandelt oder ihn zum Fluoreszieren bringt. Die Dünnschichtplatten werden nach dem Auftrennen der Stoffe mit den Hefezellen beschichtet. Anschliessend werden die Platten mit dem Indikator besprüht und ihre Fluoreszenz gemessen.

Maskierte östrogene Effekte werden sichtbar

Alan Bergmann wendete den Dünnschichtplatten-YES (planar YES = P-YES) zunächst auf dreizehn bekannte Östrogene in verschiedenen Konzentrationen an und verglich sie mit dem Standard-Mikrotiterplatten- YES (L-YES). Es zeigte sich, dass die neue Methode die Stoffe akkurat nachweisen kann und deutlicher sensitiver ist. Auch die relative Potenz der Stoffe – also die Stärke ihrer östrogenen Wirkung – wurde in beiden Tests übereinstimmend angezeigt. Anschliessend setzte Alan Bergmann den Test ein, um Lebensmittelverpackungen zu untersuchen. Die Verpackungen extrahierte er zunächst mit Lösungsmitteln: So wurden die Bedingungen simuliert, unter denen Stoffe aus der Verpackung in die Nahrung übergehen können.

„In Extrakten einiger beschichteter Konservendosen haben wir mit dem P-YES Stoffe mit östrogener Wirkung nachgewiesen, die im klassischen L-YES nicht sichtbar waren», berichtet Alan Bergmann. „Diese Proben hemmten in der höchsten getesteten Konzentration auch das Wachstum der Hefezellen.“ Es könne also sein, dass der Extrakt andere Stoffe enthielt, die für die Zellen toxisch sind und so die östrogene Wirkung maskieren. Beim P-YES werden zelltoxische Stoffe von östrogenen Stoffen getrennt, dadurch wird eine solche Überlagerung der Wirkungen vermieden. „Diese Maskierung der östrogenen Wirkung konnten wir auch bei einigen stark belasteten Gewässerproben beobachten“, sagt Alan Bergmann.

Komplexität der Proben kann reduziert werden

Die Auftrennung des Stoffgemischs in kleinere Stoffgruppen macht es ausserdem möglich, die wichtigen Stoffe zu identifizieren: Während der Konservenextrakt mehr als 700 verschiedene Chemikalien enthielt, reduzierte dies die Dünnschichtchromatographie auf nur noch 9 Chemikalien in der östrogenen Bande. Ein bekanntes Östrogen, das zur Kunststoffherstellung eingesetzt wird und so auch in Lebensmittelverpackungen enthalten sein kann, ist Bisphenol A. Die Nachweisgrenze für Bisphenol A lag im neuen P-YES bei 2 ng, das ist 20mal empfindlicher als im L-YES. Dies erlaubt es, Bisphenol A in Konzentrationen nachzuweisen, die deutlich unter dem gesetzlich zulässigen Migrationsgrenzwert für Lebensmittelverpackungen liegen. Der Wert gibt an, welche Menge eines Stoffes aus der Verpackung maximal in das Lebensmittel übergehen darf.

Nachweis der Gentoxizität

Eine zweite Stoffklasse, die in Lebensmittelverpackungen überwacht werden muss, sind die gentoxischen Stoffe, die DNA schädigen. Diese können bei der Herstellung der Verpackungen unbeabsichtigt entstehen und sind schon in geringsten Mengen toxisch. Um die Stoffe nachzuweisen, kann ein Biotest mit genetisch veränderten Salmonellen eingesetzt werden. Der Test weist über die Induktion des umuC-Gens die Aktivierung des Reparatursystems der Zellen nach, das die DNA-Schäden beheben soll. An das umuC-Gen ist ein Reportergen gekoppelt, das ein Enzym produziert und so eine Farbreaktion hervorruft.

Auch dieser Standard-Biotest wurde bis jetzt in Mikrotiterplatten durchgeführt, doch in diesem Projekt neu für Dünnschichtplatten angepasst. Das heisst, die Salmonellen wurden nach der Auftrennung der Stoffe auf die Dünnschichtplatte gesprüht und die positiven Banden über ihre Fluoreszenz sichtbar gemacht. Das Funktionieren des neuen Systems testete Alan Bergmann mit Extrakten von Kartonverpackungen, die mit 4-Nitrochinolin-1-oxid (NQO), einem bekannten gentoxischen Stoff, versetzt worden waren. Bei einigen der Materialien wies der Test auch ohne zugesetztes NQO Effekte nach, diese Kartons enthielten also gentoxische Stoffe, die herausgelöst werden können. Auch diese Extrakte hemmten in grösserer Konzentrationen das Zellwachstum im Mikrotitertest. Der Test liess sich auf  Trinkwasser- und Abwasserproben ebenfalls gut anwenden. Die Nachweisgrenze für gentoxische Stoffe war ausreichend niedrig, um diese in Lebensmittelverpackungen in regulatorisch relevanten Konzentrationen zu detektieren, also  Konzentrationen unterhalb des kritischen Schwellenwerts für toxische Wirkungen (TTC = threshold of toxicological concern).

„Als nächstes möchten wir den umuC auf eine grössere Zahl von gentoxischen Chemikalien anwenden und die Ergebnisse zwischen dem Dünnschichttest und dem Mikrotitertest vergleichen“, sagt Alan Bergmann. Auch die Untersuchung von weiteren Lebensmittelverpackungen und Trinkwasserproben steht auf dem Programm. Ausserdem werden die Forscher an der Identifizierung der verantwortlichen Stoffe mit Hilfe von Massenspektrometrie weiterarbeiten. „Die neue Methode ist für kantonale Labors interessant, die Lebensmittelverpackungen routinemässig kontrollieren“, sagt Alan Bergmann. Es besteht bereits eine Zusammenarbeit mit den kantonalen Labors von Zürich und St. Gallen, die einige Proben für die Analysen zur Verfügung gestellt haben.

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