Östrogene im Wasser – Screening und Risikobewertung für Europa

In einem internationalen Projekt wurden europäische Wasserproben mit verschiedenen biologischen und chemischen Methoden auf Östrogene untersucht. Es zeigte sich, dass Biotests auf der Basis von Zellkulturen sehr gut geeignet sind, um die Stoffe nachzuweisen, die europaweit überwacht werden sollen.

Hormonaktive Stoffe können zur Verweiblichung von Fischen führen, ihr Immunsystem beeinträchtigen und auch andere empfindliche Wassertiere negativ beeinflussen: Dies haben zahlreiche wissenschaftliche Studien gezeigt. Besonders potent sind die steroidalen Östrogene wie die Hormone 17β-Estradiol (E2) und 17α-Ethinyl-Estradiol (EE2) und das Transformationsprodukt Estron (E1). Während E1 und E2 natürlich von Menschen und Tieren gebildet werden, wird das Hormon EE2 synthetisch hergestellt und zur Empfängnisverhütung eingesetzt. Da diese Stoffe kontinuierlich über Abwasser in Flüsse eingetragen werden und E2 und EE2 eine hohe biologische Aktivität haben, können schon sehr kleine Konzentrationen ganze Populationen negativ beeinflussen. Daher hat die EU alle drei Substanzen in die sogenannte „Watch List“ für potentiell schädliche Stoffe aufgenommen. Die Umweltkonzentrationen dieser Stoffe sollen regelmässig gemessen werden, damit ihr Umweltrisiko zukünftig besser beurteilt und reguliert werden kann.

Niedrige Nachweisgrenze notwendig

Die chemische Analyse der Stoffe ist zur Zeit noch eine Herausforderung und erreicht oft nicht die sehr niedrigen geforderten Nachweisgrenzen. Diese sollten nämlich wenigstens den jeweiligen vorgeschlagenen ökotoxikologischen Grenzwert (environmental quality standard, EQS) für chronische Belastungen erreichen, da ab dieser Konzentration ein Risiko für schädliche Effekte bei Organismen besteht: Die dafür vorgeschlagenen Werte liegen in der EU für E1 bei 3600 pg/L, für E2 bei 400 pg/L und für EE2 bei 35 pg/L.

„Biologische Methoden sind in der Lage, die Stoffe schon in sehr geringen Konzentrationen nachzuweisen“, sagt Projektkoordinator Robert Kase vom Oekotoxzentrum. „Sie könnten also für ein Screening eingesetzt werden und die chemische Analytik beim Monitoring ergänzen.“ Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass Biotests kein Vorwissen über die Stoffe in einer Probe erfordern, und sie die biologische Antwort auf Mischungen auch unbekannter Substanzen mit der gleichen Wirkung analysieren können.

Für den Nachweis von Östrogenen werden meist zellbasierte Rezeptortests genutzt, in denen die Bindung von Substanzen an den menschlichen Östrogenrezeptor über ein gekoppeltes Reportergen sichtbar gemacht werden kann. Dafür werden Hefezellen, menschliche Zellen oder andere Säugetierzellen eingesetzt. „Die Systeme sind sehr gut geeignet, um die geringen Östrogenkonzentrationen in Oberflächengewässern zu bestimmen“, erklärt Robert Kase. „Dennoch empfehlen die EU-Behörden die Verfahren noch nicht für die Anwendung in den Monitoring-Programmen der Wasserrahmenrichtlinie. Das liegt daran, dass es nicht genügend systematische Daten zu ihrer Anwendbarkeit als Monitoring- und Screeningmethoden gibt.“

Europaweite Probenahme und Zusammenarbeit

Daher hat das Oekotoxzentrum - zusammen mit dem Istituto Superiore di Sanità (IT) und der EU Komission - ein internationales Projekt koordiniert. In dem Projekt wurde der Nutzen von zellbasierten Biotests für den Nachweis von EE2, E2 und E1 in Fliessgewässern und Abwasser evaluiert. Dazu verglichen Wissenschaftler aus der Schweiz, Deutschland, Italien, Frankreich, Tschechien und den Niederlanden neue Daten aus der chemischen und der biologischen Analyse von insgesamt 16 Fliessgewässerproben und 17 Abwasserproben aus ganz Europa. Drei Labors analysierten die Proben chemisch mit hochauflösender Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (LC-MS/MS) und Elektrosprayionisation. Fünf Labors setzten verschiedene zellbasierte Rezeptortests zum Nachweis östrogen aktiver Substanzen ein: Dies waren die kommerziellen ER-CALUX und ER-GeneBLAzer Systeme, und die nicht-kommerziellen MELN, HeLa-9903 und pYES Tests. Für den pYES Test werden Hefezellen verwendet, für die anderen dagegen menschliche Zellkulturen.

„Mit chemischen Analysen konnten die potenteren Östrogene E2 und EE2 nur in einem Teil der Proben gut quantifiziert werden“, berichtet Robert Kase. „Der Grund dafür war, dass die Nachweisgrenzen zu hoch lagen.“ E2 konnte in 4% der Oberflächengewässerproben nicht in den geforderten Konzentrationen detektiert werden, für EE2 waren es 44% der Proben. Dies war bei den Abwasserproben noch stärker ausgeprägt, da diese mehr Verunreinigungen enthalten, die die Analytik behindern. Die biologischen Rezeptortests waren in der Lage, die Hormone in Konzentrationen nachzuweisen, die ungefähr zehnfach unterhalb der chemischen Bestimmungsgrenze lagen. Ansonsten war die Übereinstimmung zwischen den gemessenen Konzentrationen in der chemischen und der biologischen Analytik hoch. Die Ergebnisse der verschiedenen Rezeptortests waren ebenfalls gut vergleichbar.

Chemisches Mischungsrisiko

Welche Methoden sind nun am besten für die Beurteilung der Gewässerqualität geeignet? Um diese Frage zu beantworten, bestimmten die Forschenden zunächst das Risiko für Populationen von Wasserorganismen (siehe Kasten). Für die chemische Analytik verglichen sie dazu die gemessenen Konzentrationen der Einzelstoffe EE2, E2 und E1 mit dem jeweiligen EQS-Vorschlag der Substanz und berechneten für jede Substanz den Risikoquotienten. Ist die Konzentration eines Einzelstoffes grösser als ihr EQS, so ist das Risiko für schädliche Wirkungen auf Organismen nicht akzeptabel. Das gleiche gilt für die Mischungseffekte von Substanzen mit gleichem Wirkmechanismus: So addierten die Wissenschaftler die Risikoquotienten für EE2, E2 und E1. Überschreitet diese Summe der Risikoquotienten 1, so besteht ein nicht akzeptables Risiko für die Mischung. Das war für 44% der Oberflächenwasserproben und 53% der Abwasserproben der Fall, wobei nur die quantifizierten Messungen berücksichtigt wurden.

Bei der Analytik mit Biotests wird die Aktivität der östrogenen Substanzen im Wasser als diejenige Konzentration des Hormons 17β-Estradiol ausgedrückt, die ebenso potent wirkt wie die unbekannte Mischung: Die Konzentration der Stoffe wird dabei in Form von 17β-Estradiol-Äquivalenten (EEQ) angegeben. Die EEQ aus der biologischen Analytik korrelierten gut mit den Summen-Risikoquotienten aus der chemischen Analytik. Dies zeigt, dass die effektbasierten Methoden dafür geeignet sind, den chemischen Status von Gewässern zu bestimmen oder belastete Proben zu identifizieren.

Triggerwerte zur Bestimmung des ökotoxikologischen Risikos

Um auch für die Biotest-Ergebnisse das Umweltrisiko zu beurteilen, benötigt man einen Schwellenwert, mit dem man die im Biotest bestimmte Gesamtkonzentration der EEQ für östrogen wirksame Stoffe vergleichen kann. Dafür können für Substanzen mit demselben Wirkmechanismus aus den vorhandenen Toxizitätsdaten sogenannte effekt-basierte Triggerwerte abgeleitet werden. Diese Werte sind derzeit nicht regulatorisch gültig. Ähnlich wie bei der konventionellen Risikobewertung mit chemischen Analysedaten und EQS zeigt die Überschreitung von Triggerwerten durch im Biotest gemessene Äquivalenzkonzentrationen ein nicht akzeptables Risiko für einen spezifischen Wirkmechanismus an (siehe Kasten). Die Ergebnisse der chemischen und ökotoxikologischen Risikobewertung war insgesamt gut vergleichbar. Je nach Biotest variierten die ökotoxikologischen Risikoquotienten etwas: So bestand für 31-50% der Oberflächengewässerproben und für 53-71% der Abwasserproben ein nicht akzeptables Risiko. Im Vergleich zu den chemischen Risikoquotienten wurde für 11% zusätzliche Proben ein nicht akzeptables Risiko identifiziert. Dies liegt zum grössten Teil daran, dass die Hormone EE2 und E2 in einem Teil der Proben chemisch nicht empfindlich genug analysiert werden konnten und so das Risiko unterschätzt wurde. Desweiteren beschränken sich die Biotests nicht auf den Nachweis von steroidalen Östrogenen, sondern weisen auch andere Chemikalien mit einer östrogenen Aktivität nach.

Rezeptortests als Screeningmethoden

Für ungefähr 15% der Gewässerproben und 41% der Abwasserproben konnten die Resultate der chemischen Analysen nicht für eine Bestimmung der Gewässerqualität verwendet werden, da mindestens eine Nachweisgrenze zu hoch lag. Die Nachweisgrenzen der ökotoxikologischen Tests lagen für alle fünf Methoden unterhalb des vorgeschlagenen Triggerwerts. Zellbasierte Rezeptortests sind daher sehr gut dafür geeignet, Wasserproben im Umweltmonitoring auf steroidale Östrogene zu screenen und die chemische Analytik zu ergänzen.

Die Rezeptortests haben folgende Vorteile: a) sie sind genügend sensitiv, um steroidale Östrogene in Oberflächen- und Abwasser zu quantifizieren, b) sie sind in der Lage, die kombinierte Wirkung von Östrogenmischungen zu erfassen, einschliesslich die Wirkung unbekannter Chemikalien, die den Östrogenrezeptor aktivieren und c) sie erlauben es, den ökotoxikologische Status zu bestimmen, indem mit Hilfe von Triggerwerten Risikoquotienten berechnet werden können. Dieser Ansatz ähnelt dem, der für die regulatorische Umwelt-Risikobewertung eingesetzt wird, erlaubt aber eine integrierte Mischungsbewertung. Zu einigen Rezeptortests werden im kommenden Jahr ISO-Standards in Kraft treten.

Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde im Herbst ein Folgeprojekt begonnen: 14 EU-Mitgliedstaaten und 4 Schweizer Kantone werden dafür über 80 Oberflächengewässerproben zur Verfügung stellen, die mit Biotests auf Östrogene und bestimmte Schmerzmittel (Cox-Inhibitoren) untersucht werden sollen. Ausserdem koordiniert das Oekotoxzentrum zusammen mit dem EU Joint Research Center, Schweden und Italien eine Arbeitsgruppe, die eine Empfehlung für die Anwendbarkeit der Biotest-Methoden in der Wasserrahmenrichtlinie der EU vorbereitet.